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La scoperta che piccoli RNA non codificanti (ncRNA) sono in grado di controllare l'espressione genica in un modo specifico della sequenza ha avuto un impatto enorme sulla biologia. I recenti miglioramenti nel sequenziamento ad alto rendimento e nei metodi di previsione computazionale hanno consentito la scoperta e la classificazione di diversi tipi di ncRNA. Sulla base delle loro strutture precursori, percorsi di biogenesi e modalità di azione, gli ncRNA sono classificati come piccoli RNA interferenti (siRNA), microRNA (miRNA), RNA interagenti con PIWI (piRNA), piccoli RNA interferenti endogeni (endo-siRNA o esiRNA), promotore associare RNA (pRNA), piccoli RNA nucleolari (snoRNA) e RNA derivati da sno. Tra questi, i miRNA appaiono come importanti regolatori citoplasmatici dell'espressione genica.
1. Biogenesi dei miRNA
La classe più studiata di piccoli RNA non codificanti (ncRNA) sono i miRNA. Sono codificati all'interno dei genomi di organismi che vanno dalle piante agli animali. È stato stimato che sono in grado di modulare fino al 60% dei geni codificanti proteine nel genoma umano a livello traslazionale [ 1 ]. A causa del loro ruolo onnipresente nella regolazione genica, sono coinvolti in molti processi fisiologici, come la differenziazione, la proliferazione, l'apoptosi e lo sviluppo, e la loro disregolazione è stata correlata a vari disturbi patologici, tra cui la distrofia muscolare [ 2 ], il diabete [ 3 ] e diversi tipi di cancro [ 4 ].
La biogenesi dei miRNA avviene attraverso un processo in più fasi che richiede sia una fase nucleare che una citoplasmatica. Sono trascritti tipicamente dalle RNA polimerasi II o III come miRNA primario lungo (pri-miRNA) con un cappuccio e una coda poli-A. I pri-miRNA contengono uno stelo a doppio filamento di circa 30 paia di basi, un anello terminale e due code a filamento singolo non strutturate laterali. I pri-miRNA vengono trasformati in brevi strutture ad anello stelo da 70 nt note come miRNA precursori (pre-miRNA) da un complesso proteico, il complesso del microprocessore, che consiste nell'enzima RNasi III Drosha e una proteina legante l'RNA a doppio filamento, Gene della regione critica 8 della sindrome di Di George (DGCR8).
L'ulteriore elaborazione dei pre-miRNA da parte dell'enzima RNasi III Dicer genera miRNA duplex (ds-miRNA) [ 5 , 6 ] con un fosfato all'estremità 5' e una sporgenza di 2 nt con un idrossile all'estremità 3' [ 7 , 8 , 9 ]. Il miRNA duplex, viene successivamente caricato su Argonaute (AGO) stesso da un complesso di silenziamento che induce l'RNA (RISC) comprendente Dicer, trans-risposta di attivazione RNA-binding protein (TRBP) e AGO. TRBP identifica i filamenti "guida" e "passeggero" nella molecola ds-miRNA. TRBP rileva le proprietà termodinamiche dei ds-miRNA e, una volta riconosciuto il filamento con l'estremità 5 'meno stabile, la proteina carica il ds-miRNA con l'orientamento corretto sulle proteine AGO. AGO svolge il duplex e rimuove il filamento passeggero trattenendo la molecola di miRNA matura [ 5 , 10 ]. Una sottoclasse di miRNA, chiamata mirtron, bypassa la scissione iniziale di Drosha e dipende invece dallo splicing e dal debranching per produrre le molecole di pre-miRNA che sono i substrati per la maturazione dei miRNA mediata da Dicer [ 11 , 12]. Un altro sottoinsieme di miRNA originati da introni corti, gli agotroni, è stato recentemente caratterizzato [ 13 ]. Gli agotroni maturi sono simili ai pre-miRNA (80–100 nt) e la loro biogenesi è indipendente sia da Drosha che da Dicer sebbene siano in definitiva associati e stabilizzati dalle proteine Argonaute (AGO) [ 14 ]. i pre-miRNA vengono traslocati nel citoplasma in un processo mediato da Exportin5 (XPO5), un membro della famiglia karyopherin β, in un complesso con Ran·GTPase [ 15 ].
2. Funzione dei miRNA citoplasmatici
Nelle piante, e raramente nei mammiferi, la perfetta complementarità tra miRNA e mRNA bersaglio induce la scissione e la rottura di quest'ultimo [ 16 ]. Negli animali, studi seminali sui miRNA hanno dimostrato che solo la regione del seme (sequenza che va dalla posizione 2 all'8 all'estremità 5'), è cruciale per il riconoscimento del bersaglio. La sequenza di semi si accoppia completamente al suo elemento reattivo principalmente nella regione 3' non tradotta (UTR) dell'mRNA bersaglio [ 17 ]. Tuttavia, gli elementi responsivi ai miRNA (MRE) sono anche ubiquitariamente diffusi nelle sequenze UTR 5 'così come nelle regioni codificanti degli mRNA [ 18 , 19 , 20]. Inoltre, i recenti progressi nel metodo dell'intero trascrittoma per la mappatura dei siti di legame dei miRNA (AGO HITS-CLIP) hanno dimostrato che un certo numero di interazioni miRNA-target in vivo sono mediate da regole di accoppiamento dei semi non canoniche (~ 15% -80%) [ 21 , 22 ].
La pietra angolare del funzionamento del miRNA è la formazione del RISC composto in minima parte da una proteina AGO e una molecola di miRNA. L'utilità di questo complesso binario è evidenziata dai seguenti fattori: (i) i miRNA possono riconoscere specificamente i loro bersagli mRNA attraverso l'accoppiamento di basi Watson e Crick e, allo stesso tempo, possono facilmente staccarsi e riattaccarsi a bersagli diversi, esercitando così il loro controllo in serie su un'ampia gamma di molecole bersaglio; (ii) le proteine AGO forniscono una piattaforma estremamente efficiente su cui i cofattori modulanti possono legare i loro bersagli. Mentre il miRNA è responsabile del riconoscimento dell'mRNA target da modulare, il compito delle proteine AGO è determinare la modalità di azione della regolazione genica mediata da RISC.Nonostante la loro elevata somiglianza di sequenza e il fatto che gli amminoacidi critici siano conservati anche in altre proteine AGO, solo AGO2 possiede attività endonucleasica, se l'accoppiamento di basi miRNA-mRNA è perfetto [23 , 24 ]. Pertanto, è ancora incerto quali siano le esatte funzioni delle diverse proteine AGO.
La capacità endonucleolitica di degradare gli mRNA cellulari non è frequentemente adottata dai RISC dei mammiferi. Molto spesso, il RISC minimo (AGO2 e miRNA) funge da piattaforma per reclutare proteine che definiscono il destino degli mRNA target del RISC [ 24 , 25 , 26]. Questi fattori sono stati raggruppati in base alle loro funzioni biologiche come: proteine necessarie per l'assemblaggio del RISC, proteine coinvolte nella regolazione traslazionale, proteine leganti l'RNA messaggero e proteine coinvolte nel metabolismo dell'RNA. Pertanto, oltre a quei fattori strettamente necessari per costruire un RISC minimo funzionale (cioè, proteine Dicer, TRBP e Hsp90, che consentono l'incorporazione dei miRNA nel RISC) è necessario un grande gruppo di proteine interagenti AGO per spiegare il meccanismo del RISC mediato regolazione genica negli animali.
3. miRNA-RISC: attività citoplasmatica
Dalla sua scoperta 20 anni fa, la funzione primaria del miRNA-RISC (miRISC) sembrava essere la regolazione post-trascrizionale dell'mRNA nel citoplasma. Sono stati proposti diversi modelli per spiegare il meccanismo utilizzato dal complesso miRNA-RISC per controllare il destino dell'mRNA. In generale, i miRISC ostacolano la traduzione o migliorano la degradazione dell'mRNA. Per molto tempo, l'idea predominante era che la variazione nella composizione dei RISC portasse a meccanismi alternativi per il controllo post-trascrizionale. Più recentemente, la prospettiva è cambiata. L'attuale modello propone che, in un processo sequenziale, il RISC spenga i suoi bersagli reprimendo inizialmente la traduzione dell'mRNA e successivamente avviando la degradazione [ 27]. Tuttavia, è stato suggerito che l'ordine sequenziale di questi due eventi riflette differenze cinetiche tra la repressione traslazionale e il decadimento dell'mRNA piuttosto che una relazione di causa ed effetto tra di loro [ 27 , 28 , 29 ].
Esperimenti di profilazione dei ribosomi [ 30 ] e profilazione dei polisomi combinati con metodi di sequenziamento ad alto rendimento hanno escluso che il controllo post-trascrizionale di miRISC avvenga attraverso l'inibizione dell'allungamento della traduzione, della degradazione delle proteine o del drop-off del ribosoma. Inoltre Bazzini et al. [ 29 ] hanno scoperto che miR-430 riduce il numero di ribosomi sugli mRNA bersaglio negli embrioni di pesce zebra di tipo selvatico e mutante Dicer, indicando che i miRNA possono regolare la traduzione in una fase di iniziazione. La rimozione della coda di poli(A) non ha influenzato la repressione traslazionale dipendente da miRISC suggerendo che la deadenilazione indotta da miRISC rappresenta un livello di controllo mediato da miRNA indipendente dalla traduzione. È vero anche il contrario; La repressione traslazionale guidata da miRNA non è richiesta per la deadenilazione dipendente da miRNA [31 ]. Bethune et al. [ 32 ] ha fornito ulteriore supporto per queste osservazioni, dimostrando che la repressione traslazionale è l'effetto dominante sui bersagli di nuova sintesi, mentre la deadenilazione e il decadimento dell'mRNA sono prevalenti allo stato stazionario.
Tuttavia, in termini quantitativi, la destabilizzazione degli mRNA bersaglio è la causa principale della ridotta produzione di proteine. In effetti, la repressione traslazionale fornisce circa il 6%-25% della repressione globale nell'espressione proteica [ 33 , 34 ]. Negli ultimi anni, il complesso CCR4-NOT è stato identificato come il principale effettore a valle del complesso RISC. Il complesso CCR4-NOT coordina la deadenilazione dell'mRNA direttamente e indirettamente, reclutando proteine PABP o elicasi DEAD box, come eIF1A e DDX6, decapping dell'mRNA e repressione traslazionale. Pertanto, diversi autori hanno esplorato i dettagli degli eventi meccanicistici e degli effettori proteici che regolano il decadimento del bersaglio mediato da miRNA e la repressione traslazionale, facendo luce sull'attività di miRISC nel citoplasma (per una rassegna vedere Jonas e Izaurralde [35 ]).
4. miRISC e miRNA: Shuttle citoplasmatico/nucleare
Negli ultimi anni, ci sono stati diversi rapporti che indicano che i complessi miRISC sono presenti anche nei nuclei delle cellule dei mammiferi. Western blot di frazioni nucleari, frazionamento cellulare e immunofluorescenza hanno rivelato la presenza di proteine AGO, Dicer, TRBP e Gw182/TNRC6 nei nuclei cellulari [ 36 , 37 , 38 , 39 ], dove si combinano per formare complessi multiproteici [ 40 ]. Eseguendo saggi di frazionamento proteico e precipitazione del solfato di ammonio su estratti nucleari e citoplasmatici HeLa, Gagnon e collaboratori [ 40] ha suggerito che la composizione dei complessi miRISC e la stabilità di legame dei loro componenti differiscono nel nucleo rispetto al citoplasma. Allo stesso tempo, hanno scoperto che il Dicer nucleare programmato con siRNA esogeni 21-nt mantiene la sua attività catalitica così come AGO2 ed è in grado di colpire gli RNA nucleari, come gli RNA nucleolari piccoli 7SK (snoRNA), inducendone la degradazione [ 40]. Tuttavia, il processo di caricamento sembrava avvenire nel citoplasma, nonostante la presenza simultanea di Dicer e TRBP all'interno del nucleo. L'ipotesi attuale è che l'assemblaggio miRNA-AGO2 avvenga al di fuori del nucleo, dove sono presenti alcuni fattori di carico critici. Una volta stabilito, il RISC minimo può essere successivamente importato nel nucleo. Questa ipotesi è in accordo con l'analisi precedente che suggerisce che il RISC nucleare sembra essere più piccolo della sua controparte citoplasmatica [ 37 ]. Più recentemente, utilizzando un approccio di spettrometria di massa semiquantitativa, Kalantari et al. [ 41] hanno confermato le piccole dimensioni del RISC nucleare, dimostrando che l'associazione di AGO2 con Gw182/TNRC6 (-A, -B, -C) e AGO3 è meglio conservata e più stabile sia nei nuclei che nel citoplasma mentre l'interazione AGO2 con Dicer e TRBP è confinato al citoplasma. Ovviamente, condizioni diverse per la purificazione biochimica possono produrre diverse composizioni del RISC.
Queste osservazioni nel complesso suggeriscono che il RISC minimo potrebbe costituire il componente principale di un macchinario più ampio progettato per modulare l'espressione genica anche nel nucleo. Tuttavia, il meccanismo che guida lo spostamento citoplasmatico-nucleare di miRISC rimane una questione aperta. Una famiglia di proteine, chiamate carioferine, media la traslocazione del RISC nel nucleo. Queste proteine riconoscono le sequenze di localizzazione nucleare nei carichi proteici e quindi assistono il loro trasporto attivo attraverso il complesso dei pori nucleari. In dettaglio, il complesso AGO-miRNA viene importato nel nucleo legandosi all'importina 8 (IPO8) [ 38 , 42 ]. Infatti, il silenziamento di IPO8 riduce il pool di AGO2 nucleare [ 38]. Ad AGO2 manca un segnale di localizzazione nucleare a differenza di molti componenti del RISC citoplasmatico, inclusi i paralog TNRC6 e Dicer [ 39 , 40 , 41 , 42 , 43 ], sebbene un recente documento metta in dubbio la compartimentazione nucleare di Dicer [ 44 ]. Tuttavia, AGO2 supera questa carenza combinandosi con TNRC6A che possiede un segnale di localizzazione nucleare (NLS) piuttosto che un segnale di esportazione nucleare (NES) e funziona come una proteina di navetta nucleare-citoplasmatica per rilocalizzare il miRISC minimo nel nucleo [ 39 , 45]. È possibile che IPO8, TNRC6A e AGO2 si localizzino insieme in corpi P citoplasmatici dove formano un complesso finale in grado di legarsi al complesso dei pori nucleari (NPC) che entra nel nucleo. D'altra parte, l'elemento NES di TNRC6A influisce sull'esportazione nucleare di AGO2. Infatti, l'inibizione dell'exportin1 (XPO1) provoca l'accumulo nucleare di entrambe queste proteine [ 39 , 46 ].
L'idea di base è che il RISC possa intraprendere più di un percorso per raggiungere il compartimento nucleare. Parallelamente all'identificazione di RISC nucleari, i miRNA sono stati rilevati nel compartimento nucleare attraverso l'analisi di microarray e il sequenziamento profondo di piccoli RNA di estratti nucleari [ 47 , 48 , 49 , 50 ]. Gagnon e collaboratori [ 40] hanno scoperto che circa il 75% dei miRNA di cellule intere sono presenti sia nel nucleo che nel citoplasma. Hanno anche dimostrato che l'abbondanza relativa di miRNA nel citoplasma riflette anche la loro proporzione relativa nel nucleo, suggerendo un'incapacità dei meccanismi di navetta citoplasmatico-nucleare dei miRNA di interiorizzare miRNA specifici. Diversi studi hanno dimostrato che i miRNA nucleari co-localizzano con TNRC6A [ 39 ], che è un componente principale del miRISC citoplasmatico. Questa scoperta ha dato origine all'idea che i miRNA possono essere riposizionati nel nucleo attraverso la spola miRISC.
In contrasto con l'ipotesi di una distribuzione non selettiva dei miRNA, diversi studi hanno suggerito l'esistenza di un meccanismo dipendente dal motivo che trasloca selettivamente i miRNA nel nucleo. Ad esempio, uno studio seminale ha riportato che un elemento esanucleotidico (AGUGUU) all'estremità 3 'di miR-29b è responsabile della sua localizzazione nucleare selettiva nelle cellule HeLa. Infatti, la traslocazione di questo motivo 6-nt ad altri piccoli RNA è in grado di indurre il loro accumulo nucleare [ 51]. Il lavoro successivo ha parzialmente confermato l'importanza delle sequenze 3′-terminali nella definizione della localizzazione cellulare dei miRNA maturi. Inoltre, è stato suggerito che i miRNA contenenti un elemento ASUS 3′ (dove S può essere una citosina o una guanosina) o un nucleotide guanina 3′-terminale, che può essere aggiunto in modo non modello, siano localizzati preferenzialmente all'interno il nucleo [ 49 , 50]. Pertanto, è possibile che esistano macchinari coinvolti in una traslocazione nucleare di miRNA dipendente dal motivo, in grado di garantire l'accesso nucleare di miRNA specifici. Tuttavia, i dati di diversi laboratori suggeriscono che qualunque sia il sistema selettivo di traslocazione nucleare del miRNA, può essere espresso in modo differenziale in vari tipi di cellule. In effetti, il pool di miRNA arricchito nei nuclei sembra essere specifico della linea cellulare. È anche utile considerare alcuni dati che dimostrano che i siRNA esogeni sono preferenzialmente in grado di localizzarsi nel citoplasma o nel nucleo in modo dipendente dall'attività di intrappolamento dei loro bersagli [ 52 , 53 ]. Si muovono avanti e indietro tra nucleo e citoplasma e vengono trattenuti nel compartimento cellulare dove identificano le loro molecole bersaglio.
5. miRNA: funzioni nucleari
Alcuni risultati dimostrano che il miRNA può avere diverse funzioni nucleari, in alcuni casi, indipendentemente dall'attività RISC. In realtà , solo un numero limitato di miRNA è rappresentativo di questi ruoli non canonici e poco si sa sul loro modo di agire.
5.1. Regolazione del trascrittoma di RNA
È stato scoperto che i miRISC inducono la degradazione post-trascrizionale di piccole molecole di RNA, come i lunghi RNA non codificanti confinati nel nucleo. Ad esempio, il miR-709 nucleare sembra inibire la maturazione del miRNA15a/16-1 legandosi a un elemento di riconoscimento 19-nt su pri-miR-15a/16-1 e bloccandone così l'elaborazione in pre-miR-15a/16- 1 nelle cellule di topo [ 54 ]. In modo simile, il miRNA maturo let-7 in Caenorhabditis elegans si associa fisicamente al proprio pri-miRNA all'interno del nucleo promuovendo l'elaborazione del trascritto del pri-miRNA e fornendo così un ciclo di feedback positivo [ 55 ].
Un'analisi imparziale delle interazioni miRNA-mRNA-Argonaute nel cervello del topo utilizzando il sequenziamento ad alto rendimento di RNA isolati mediante immunoprecipitazione di cross-linking [ 56 ] ha mostrato che il 4% dei tag AGO-mRNA è mappato su RNA lunghi non codificanti (lncRNA). I LncRNA sono lunghi > 200 basi con un potenziale di codificazione proteico basso o nullo. Questi RNA spesso regolano il silenziamento epigenetico dei geni attraverso il rimodellamento della cromatina. Diverse linee di evidenza suggeriscono che i livelli di espressione di lncRNA possono subire una regolazione guidata da miRNA nel nucleo. Da questo punto di vista, specifici complessi AGO-miRNA sembrano in grado di mirare a sequenze complementari di miRNA all'interno di lncRNA influenzandone la stabilità e la funzione [ 57 , 58 , 59 , 60 , 61]. Pertanto, questi risultati rivelano una possibile nuova funzione nucleare dei miRNA: i miRNA potrebbero contribuire alla regolazione del trascrittoma di RNA non codificante.
5.2. Funzione nucleare
È stato scoperto che i miRNA sono significativamente concentrati nel nucleolo sia come pre-miRNA che come miRNA maturi [ 62 , 63 ]. Sono state proposte varie ipotesi per descrivere le possibili funzioni biologiche dei miRNA nucleolari [ 63 , 64 ]. Ad esempio, il fatto che il miR-206 co-localizzi con l'RNA ribosomiale 28S (rRNA), sia nel nucleolo che nel citoplasma nelle cellule di mammifero, può suggerire che il miRNA possa associarsi con le subunità ribosomiali in una fase iniziale della biogenesi del ribosoma [ 65 ] . Come mostrato da Atwood et al. [ 66], il RISC minimo (AGO2 e miRNA) può influenzare l'abbondanza di rRNA nelle cellule. Inoltre, il legame di RISC minimo all'rRNA 45S sembra essere sensibile al knockdown di Dicer e al trattamento con actinomicina D, suggerendo che il legame di AGO2 sull'rRNA dipende dalla presenza di miRNA e allo stesso tempo richiede un'attività Pol I in corso. Sulla base di questi risultati, è possibile ipotizzare che gli rRNA mirati ai miRNA possano conferire ai ribosomi maturi alcune proprietà specifiche che aiutano a definire la loro interazione con le proteine accessorie. Reyes-Gutierrez et al. [ 67] hanno anche proposto che i miRNA si leghino ad alcuni bersagli mRNA nel nucleolo prima della loro esportazione nel citoplasma dove gli mRNA arrivano in uno stato pre-silenziato. In alternativa, i nucleoli possono costituire il sito di immagazzinamento dei miRNA, che vengono ridistribuiti nel nucleoplasma e/o nel citoplasma in seguito a stress genotossico [ 64 ], evocando così il ruolo ancestrale del RISC come sistema di difesa del genoma.
Inoltre, è stato suggerito che i pri e i pre-miRNA possano essere modificati da A a I nel nucleolo, poiché diversi enzimi di modifica dell'RNA, come le adenosina deaminasi (ADAR), si accumulano nel nucleolo. Questa modifica inibirebbe la maturazione dei miRNA e quindi ridurrebbe la disponibilità cellulare dei miRNA maturi [ 68 ], anche se fino ad oggi non sono stati identificati miRNA modificati nel pool di miRNA nucleolari [ 62 , 65 , 69 , 70 ]]. Tutti insieme, i modelli sopra menzionati collegano i miRNA con i nucleoli e indicano che è necessaria la compartimentazione nucleolare dei miRNA per influenzare la regolazione post-trascrizionale dell'mRNA nel citoplasma. Pertanto, il movimento dinamico dei miRNA da e verso il nucleolo fa parte del programma di regolazione dell'mRNA, che alla fine termina nel citoplasma.
5.3. Regolamento dello splicing alternativo
Un'idea emergente è di un'ipotetica coordinazione tra il controllo genico mediato da miRNA e gli eventi di splicing nelle reti di regolazione genica. Diversi studi hanno suggerito che la maturazione di miRNA specifici può dipendere da fattori di splicing [ 71 , 72 ]. I test di immunoprecipitazione per le proteine nucleari AGO1 e AGO2 hanno evidenziato la loro interazione con i componenti principali del macchinario di splicing e diversi fattori di splicing [ 73] sottolineando l'interdipendenza tra i due percorsi. Al fine di definire entrambi i siti target di AGO2 nucleare e miRNA su scala trascrittomica, sono stati utilizzati saggi di immunoprecipitazione incrociata accoppiati con analisi di sequenziamento ad alto rendimento (HITS-CLIP). Attraverso questi test, i siti di legame AGO2 e miRNA sono stati identificati all'interno di sequenze introniche, con una frequenza che varia dal 12% al 15% in campioni cerebrali di topo e umano, rispettivamente, e fino al 3% nelle cellule del miocardio umano [ 56 , 74 , 75]. Questi risultati costituiscono un importante punto di partenza per supportare l'idea del coinvolgimento dei miRNA nel programma di splicing cellulare. Tuttavia, non si può escludere in questo momento che le sequenze isolate rappresentino tratti intronici trattenuti presi di mira da RISC nel citoplasma [ 74 ]. Sarà necessario un lavoro futuro per rispondere a questa domanda e per identificare specifici miRNA in grado di modulare lo splicing alternativo.
Studi funzionali hanno infatti dimostrato la capacità delle proteine AGO di reindirizzare lo splicing solo in associazione con piccoli RNA esogeni [ 76 , 77 ] o con piccoli RNA endogeni diversi dai miRNA [ 73 ]. I dati ottenuti da questi studi non sono in completo accordo e descrivono due possibili modalità di azione per spiegare la partecipazione di miRISC alla modulazione dello splicing. Alló et al. [ 76 ] hanno rivelato che piccoli RNA duplex, che prendono di mira sequenze sia introniche che esoniche, vicino a esoni alternativi, potrebbero favorire l'inclusione dell'esone variante. Questo processo, dipendente da AGO1, è associato a un aumento di H3K9me2 e H3K27me3 ed è sensibile al knockdown della proteina 1 dell'eterocromatina (HP1), suggerendo un modus operandidi miRISC simile a quello proposto per il silenziamento genico trascrizionale guidato da miRNA. Più recentemente, Alló et al. [ 78 ] hanno anche scoperto che circa l'80% dei cluster AGO1 nucleari si associa a potenziatori trascrizionali e non trascrizionali e quindi influenza lo splicing alternativo e costitutivo più della trascrizione dei geni vicini. Conclusioni simili sono state raggiunte da Ameyas-Zazoua et al. [ 73]. Hanno dimostrato che AGO1 e AGO2 sono necessari per indurre il rimodellamento della struttura della cromatina e l'efficienza dello splicing. Per valutare l'impatto dell'esaurimento del piccolo RNA endogeno su eventi di splicing alternativi, entrambi i gruppi Alló e Ameryas-Zazoua hanno testato l'effetto del knockout di Dicer sull'esito dello splicing. I dati suggeriscono che piccoli RNA dipendenti da Dicer, come piccoli RNA e miRNA endogeni, sono necessari per mantenere il modello di splicing cellulare. Inoltre, i due studi sono d'accordo nel proporre una trascrizione antisenso, piuttosto che pre-mRNA, come bersaglio di controllo dello splicing mediato da RISC. Al contrario, Liu et al. [ 77 , 79] hanno suggerito che entrambi i duplex, le molecole di RNA e gli RNA a filamento singolo complementari alle sequenze vicino alle giunzioni esone/introne, possono modulare lo splicing portando AGO2 ai pre-mRNA. Questi piccoli oligonucleotidi indurrebbero il salto dell'esone in modo indipendente dalla modifica della cromatina. Il modello proposto significa che RISC lega la trascrizione nascente e quindi compromette il reclutamento del complesso spliceosomale alle giunzioni di giunzione senza influenzare i livelli e la stabilità della trascrizione pre-mRNA.
5.4. Ruolo trascrizionale dei miRNA
Sappiamo che i siRNA possono regolare la trascrizione genica [ 80 ], derogando così alla più consolidata attività di interferenza dell'RNA. Il fatto che i miRNA possiedano una dimensione paragonabile a quella dei siRNA, insieme all'idea che i miRNA e gli elementi RISC siano presenti nel nucleo, ha portato all'esame della loro capacità di regolare l'espressione genica a livello trascrizionale. Un numero importante di studi ha dimostrato che i miRNA possono mediare l'attivazione del gene trascrizionale (TGA) o il silenziamento del gene trascrizionale (TGS), ampliando così lo spettro delle attività dei miRNA e rivelando che i miRNA possono funzionare non solo a livello post-trascrizionale. Il primo miRNA identificato come attivatore della trascrizione genica (TGA) è stato il miR-373 umano, che ha indotto la trascrizione sia di E-caderina ( CDH1) e la proteina 2 contenente il dominio cold shock ( CSDC2 ) [ 81 ]. Un discreto numero di segnalazioni ha successivamente confermato questa osservazione. Altri miRNA sono stati anche identificati come attivatori della trascrizione genica suggerendo l'esistenza di un nuovo e diffuso meccanismo di regolazione dell'espressione genica guidata dai miRNA [ 82 , 83 , 84 , 85 , 86 , 87]. Questi studi hanno portato all'identificazione delle condizioni richieste per il TGA guidato da miRNA ma non alla biochimica di questo processo o alla relazione tra gli effettori delle proteine. Un requisito per il TGA è la presenza, nei promotori genici, di una sequenza di DNA complementare alla regione del seme 5′ nel miRNA e parzialmente alla regione fiancheggiante. Tuttavia, non è chiaro se la complementarità totale o parziale della regione del seme sia un forte determinante per il TGA.
Il reclutamento di proteine AGO (principalmente AGO2) [ 83 ] e l'arricchimento di RNApolII [ 83 , 85 ] presso i promotori genici regolati, nonché la modifica dei segni della cromatina (aumento dei segni dell'attivatore come H3K4me3) accompagnano il miRNA TGA [ 83 ]. Come accennato in precedenza, nel nucleo umano sono stati identificati diversi componenti di miRISC. Inoltre, un miRISC esiste nel nucleo ed è caratterizzato da una complessità diversa rispetto a quella citoplasmatica. Le proteine AGO, Dicer1, TARBP2 e Gw182/TNRC6, sono state identificate nel nucleo e sembrano essenziali per mediare i ruoli trascrizionali dei miRNA [ 36 , 37 , 39 , 40 , 88 ,89 , 90 , 91 ]. Sebbene il meccanismo o la sequenza di eventi mediante i quali i miRNA inducono TGA siano tutt'altro che completamente compresi, sono state proposte diverse ipotesi sulla base dei dati disponibili. Un possibile meccanismo risiede nell'osservazione della pervasione della trascrizione bidirezionale nel genoma umano. Il genoma umano è trascritto in entrambe le direzioni senso e antisenso [ 92 , 93 , 94 , 95]. Sebbene il ruolo della trascrizione bidirezionale non sia chiaro, sappiamo che ha origine in trascritti antisenso non codificanti (principalmente lncRNA) che si sovrappongono a promotori di senso. Il ruolo di queste trascrizioni non codificanti sarebbe quello di reprimere la trascrizione di geni adiacenti mediante il reclutamento di complessi repressivi, che consistono principalmente in effettori e modificatori della cromatina in stretta prossimità di promotori genici mirati. Il riconoscimento da parte della regione del seme di miRNA di una sequenza perfettamente corrispondente all'interno di una trascrizione del promotore non codificante recluterebbe un RISC nucleare e indurrebbe la scissione della trascrizione non codificante antisenso, la rimozione degli effettori della cromatina e la derepressione della corrispondente trascrizione del senso [ 96 , 97 ] (Figura 1UN). Un meccanismo alternativo è che la sequenza del seme di miRNA riconosce una sequenza complementare nella regione del promotore UTR 5' di un RNA nascente o in un trascritto del promotore non codificante (pRNA). In questo caso, il miRISC minimo (AGO-miR) recluterebbe un complesso proteico in una regione del promotore del gene, costituito da proteine e attivanti modificatori della cromatina in grado di spostare la struttura della cromatina verso una disposizione più permissiva e quindi aumentare i livelli di trascrizione genica [ 85 ] (Figura 1B). Questa ipotesi di reclutamento è supportata dall'osservazione che il miRNA TGA è indipendente dalla scissione dell'RNA bersaglio [ 85 ].
Esempi di meccanismi alternativi di attivazione del gene trascrizionale guidato da miRNA (TGA). ( A ) Gli RNA lunghi non codificanti (lncRNA) o gli RNA associati al promotore (pRNA) possono silenziare l'espressione genica reclutando un complesso repressivo trascrizionale. i miRNA che prendono di mira una sequenza complementare all'interno dell'lncRNA o del pRNA recluterebbero un RISC nucleare e indurrebbero la scissione del trascritto lncRNA o pRNA antisenso promuovendo l'esclusione del complesso repressivo e la derepressione della trascrizione del senso; ( B ) In alternativa, i miRNA inducono l'attivazione genica reclutando un complesso proteico costituito da attivatori trascrizionali. TNRC6A, trinucleotide contenente ripetizioni 6A; TRBP, proteina legante l' RNA della risposta di transattivazione; FA, Argonauti; TF, Fattore di trascrizione.
D'altra parte, è stato anche scoperto che i miRNA inducono TGS. Il primo rapporto che descrive il TGS indotto da miRNA è stato di Kim et al. [ 98 ]. Kim et al. ha descritto l'attività di silenziamento trascrizionale di miR-320. Questo miRNA, codificato all'interno della regione del promotore del gene POLR3D nell'orientamento antisenso, ha diretto l'inibizione trascrizionale POLR3D attraverso il reclutamento di AGO1, componente del gruppo Polycomb (PcG) EZH2 e cambiamenti della cromatina osservati nel tri-metil istone H3 lisina 27 (H3K27me3) repressivo arricchimento del segno. Successivamente sono stati riportati numerosi altri esempi di miRNA che inibiscono la trascrizione di un singolo gene o di piccoli gruppi di geni [ 99 , 100 , 101 , 102]. Inoltre, noi e altri autori abbiamo dimostrato che la repressione trascrizionale guidata dai miRNA può influenzare le attività cellulari generali, come la senescenza, la rigenerazione dei nervi e la granulopoiesi [ 91 , 103 , 104 ].
È sorprendente che entrambe le attività (TGA e TGS) richiedano caratteristiche, componenti ed effettori simili, suggerendo che questi due eventi biologici apparentemente opposti sono strettamente correlati funzionalmente. Ad esempio, è in generale accordo sul fatto che il miRNA TGS richieda l'esistenza di una trascrizione antisenso sovrapposta al promotore, la presenza di corrispondenze di semi di miRNA nel filamento trascritto antisenso e il reclutamento della proteina AGO1 e/o AGO2 nel promotore del gene, ma differisce da TGA nel rilascio di RNAPolII. In TGS, le modificazioni epigenetiche hanno un ruolo più importante che in TGA. Il reclutamento di proteine PcG, la modifica dei livelli di H3K27me3 (aumento) e H3K4me3 (diminuzione) e la metilazione del DNA sono frequentemente osservati nelle regioni del promotore regolate dal miRNA. Sebbene siano stati identificati gli effettori proteici del miRNA TGS,la natura del meccanismo di riconoscimento e dell'interazione tra miRNA e promotori mirati rimane poco chiara. Numerosi studi suggeriscono un'interazione diretta tra la sequenza del seme di miRNA e la sequenza complementare nel filamento trascritto, principalmente nell'orientamento antisenso, del promotore che si sovrappone al promotore stesso. In questa prospettiva, l'RNA associato al promotore non codificante mirato al miRNA (pRNA) rappresenterebbe una piattaforma di aggancio per un complesso inibitorio proteico costituito da elementi delle proteine RISC (AGO e Dicer1), elementi PcG (YY1, EZH2 e SUZ12), e modificatori della cromatina. Questa interazione consentirebbe a un complesso di inibitore proteico di trovarsi in prossimità della regione del promotore bersaglio, la cui struttura della cromatina verrebbe modificata per stabilire uno stato trascrizionale non permissivo (la cui struttura cromatinica verrebbe modificata per stabilire uno stato trascrizionale non permissivo (figura 2UN). Questo modello si basa sull'evidenza di studi sul trascrittoma che rivelano che oltre il 70% dei promotori genici è sovrapposto da trascrizioni di RNA non codificanti [ 105 ] e che le sequenze di promotori genici sono arricchite con potenziali siti target di miRNA [ 106 ] sia nell'orientamento senso che antisenso . Le procedure sperimentali che utilizzano gapmer sintetici o approcci siRNA per inattivare la funzione del pRNA supportano i risultati dell'analisi genomica [ 89 , 95 , 96 , 97 ].
Esempi di meccanismi alternativi di silenziamento genico trascrizionale guidato da miRNA (TGS). I miRNA possono inibire l'espressione genica a livello trascrizionale. ( A ) In questo caso, l'RNA associato al promotore non codificante mirato al miRNA rappresenterebbe una piattaforma di aggancio per un complesso inibitorio proteico costituito da elementi di RISC, proteine PcG e modulatori della cromatina. Questa interazione consentirebbe a un complesso di inibitore proteico di trovarsi in prossimità della regione del promotore mirato, la cui struttura della cromatina verrebbe modificata per stabilire uno stato trascrizionale non permissivo; ( B) In alternativa, il riconoscimento guidato da miRNA e l'interazione con le regioni promotrici possono avvenire attraverso un'interazione diretta tra RNA e sequenze complementari di DNA a filamento singolo. DNMT, DNA metiltransferasi; HDAC, istone deacetilasi; FA, Argonauti; EZH2, potenziatore di zeste omologo 2; Fattore trascrizionale, TF; RNA polimerasi II, RNApolII.
Tuttavia, è noto che i piccoli RNA sono in grado di ibridarsi non solo con altri RNA, ma anche con il DNA a doppio filamento per formare triplex di RNA*DNA:DNA relativamente stabili tramite Hoogsteen o accoppiamenti di basi di Hoogsteen invertiti [ 107 , 108 , 109 , 110 ]. Pertanto, i meccanismi alternativi del TGS diretto da miRNA dovrebbero essere studiati e presi in considerazione. La prima evidenza di regolazione trascrizionale attraverso la formazione di una struttura triplex RNA*DNA:DNA deriva dalle osservazioni di Martianov et al. [ 111 ]. Questi ricercatori hanno osservato la repressione RNA-dipendente del gene principale della diidrofolato reduttasi ( DHFR) da un trascritto regolatorio non codificante trascritto dal promotore minore a monte di questo gene. Questo RNA non codificante ha indotto la repressione trascrizionale specifica del promotore attraverso l'interruzione della formazione del complesso di pre-inizio al principale promotore DHFR. Al fine di dimostrare la specificità della repressione RNA-dipendente, Martianov et al. [ 111] ha studiato le proprietà del principale promotore DHFR. Questo promotore è risultato essere ricco di contenuti GC e conteneva diverse sequenze G-track. Tali sequenze avevano precedentemente dimostrato di formare strutture triplex purine-purina-pirimidina stabili (forma H) tra DNA e RNA. Pertanto, hanno analizzato la formazione della struttura triplex stabile tra il principale promotore DHFR e il trascritto normativo. Un test di spostamento della banda in forma H standard ha rivelato la formazione di uno specifico complesso DNA-RNA. È interessante notare che un piccolo oligoribonucleotide sintetico, corrispondente al nucleo del promotore principale, ha ricapitolato gli effetti del trascritto regolatorio e ha formato una forma H stabile con il DNA del promotore, suggerendo che piccoli RNA (come i miRNA) hanno il potenziale per colpire il DNA a doppio filamento .
L'esistenza di strutture RNA*DNA:DNA che regolano la trascrizione è ulteriormente supportata dal lavoro svolto da Schmitz et al. sul meccanismo di repressione trascrizionale dei geni rRNA silenziosi [ 112 ]. Questi rRNAi geni sono silenziati da NoRC, che richiede l'associazione con il pRNA per la sua funzione. Questo pRNA ha origine da un promotore della RNA polimerasi I situato a monte del sito di inizio della trascrizione del pre-rRNA. La funzione NoRC dipende dall'interazione con la sequenza di formazione della forcina del pRNA. Tuttavia, il pRNA espresso ectopicamente privo di questa sequenza è stato in grado di indurre l'ipermetilazione del DNA e il silenziamento genico, nonché il pRNA a lunghezza intera. L'espressione ectopica di diverse forme troncate di pRNA ha rivelato che la repressione trascrizionale è stata indotta fintanto che la sequenza di RNA corrispondente al sito T 0 (il sito di legame per il fattore di trascrizione TTF-1) su rDNA è stata conservata. Pertanto, un tratto di 20-nt corrispondente alla sequenza del DNA T 0 era sufficiente per garantire la repressione trascrizionale del silenziogeni rRNA . Inoltre, in saggi di mobilità in vitro e di protezione del DNA, è stata osservata la possibile formazione di una struttura triplex formata da un piccolo tratto di 20-nt nel pRNA e nella sequenza del DNA T 0 . Questi studi, insieme all'osservazione che i siti target a tripla elica sono risultati sovrarappresentati nei promotori dei geni umani [ 113 , 114 ], forniscono approfondimenti innovativi che descrivono meccanismi d'azione alternativi di piccoli ncRNA (inclusi i miRNA) in TGS. Tuttavia, l'esistenza in vivo dei triplex di RNA*DNA:DNA e il loro ruolo devono ancora essere convalidati.
In alternativa, l'osservazione che piccoli RNA possono interagire direttamente con il DNA promotore a doppio filamento fornisce una seconda possibilità , che il riconoscimento guidato dall'RNA e l'interazione con le regioni del promotore possono avvenire attraverso un'interazione diretta tra RNA e sequenze complementari di DNA a filamento singolo. Questo punto di vista è stato proposto da Jacob e Monod, i quali hanno sostenuto che la complementarità delle basi consentirebbe all'RNA di interagire specificamente con altre sequenze di acidi nucleici al fine di stabilire e trasmettere diverse attività , tra cui l'attivazione trascrizionale, l'inibizione, il reclutamento di effettori proteici e la modifica della cromatina, a specifici luoghi. Alcuni dati sperimentali sostanziano un modello basato sul riconoscimento e sull'interazione diretta tra piccoli RNA e sequenze di DNA complementari ai promotori genici. Per quanto riguarda TGA, Zhang et al. [113 ] hanno riportato che alcuni miRNA cellulari nelle cellule mononucleate del sangue periferico umano si associano a RNApolII e alla proteina legante TATA. È stato anche scoperto che si legano direttamente ai motivi della scatola TATA sui promotori genici, inducendo la trascrizione del gene bersaglio. Inoltre, Nakama et al. [ 114 ], attraverso saggi di immunoprecipitazione dell'RNA, hanno mostrato che un ncRNA, trascritto da entrambi i filamenti di dh centromericoripetizioni nel lievito di fissione, è stato associato alla cromatina attraverso la formazione di un ibrido DNA-RNA. La presenza di ibridi DNA-RNA nella cellula è stata confermata dall'analisi di immunofluorescenza con un anticorpo ibrido anti-DNA-RNA. La sovraespressione o l'esaurimento della RNasi H negli esperimenti in vivo ha portato rispettivamente a livelli ridotti e aumentati nella quantità dell'ibrido DNA-RNA che si è formato e in entrambi gli esperimenti sono stati indotti cambiamenti dell'eterocromatina.
Valutazioni importanti possono essere fatte anche da studi che valutano specificamente il meccanismo del TGS guidato da miRNA. Ad esempio, abbiamo dimostrato che il miR-223 guida il TGS di NFI-A attraverso due sequenze di DNA all'interno della regione del promotore NFI-A complementare alla sequenza di semi del miR-223 [ 91 ]. Abbiamo dimostrato attraverso molteplici approcci che durante la granulopoiesi umana, il miR-223 è entrato nel nucleo e si è localizzato nelle sue sequenze complementari sull'NFI-Apromotore. Questi approcci includevano la microscopia confocale di miR-mimici fluorescenti trasfettati e l'ibridazione in situ al miRNA endogeno con oligonucleotidi fluorescenti complementari alla sequenza di miR-223. Abbiamo anche rilevato segnali specifici di miR-223 sulle diffuse cromosomiche mitotiche da cellule in fase di differenziazione mieloide. Questi segnali erano rilevabili su regioni simmetriche di cromatidi fratelli, suggerendo una localizzazione gene-specifica. Poiché la sintesi dell'RNA è bloccata durante la metafase, questa scoperta può supportare una visione per cui il miR-223 si lega direttamente al DNA su sequenze specifiche. Combinando la trasfezione di un miR-223 marcato con Cy5 con l'immunoprecipitazione della cromatina anti-Cy5, siamo stati in grado di dimostrare che il miR-223 interagisce con l' NFI-ADNA promotore. Qui, miR-223 fa parte di un complesso repressivo ribonucleoproteico che coinvolge YY1, Dicer1 e AGO1. La localizzazione di questo complesso sul promotore NFIA era RNA-dipendente, poiché era prevenuta dalla RNasi H che riconosce specificamente gli ibridi RNA:DNA. Inoltre, in esperimenti con linee cellulari stabili progettate per esprimere una cassetta promotore-luciferasi che include ~ 1,4 kb di NFI-Apromotore, l'integrità delle due sequenze di DNA del miR-223 complementari al seme del miR-223 è risultata necessaria per l'inibizione trascrizionale. I nostri dati suggeriscono che il TGS mediato da miR-223 può verificarsi tramite un meccanismo che non si basa sulla trascrizione antisenso, poiché non si verifica quando vengono utilizzati costrutti reporter. Sulla base delle nostre osservazioni, tuttavia, preferiamo invece un meccanismo che richiede un'interazione RNA:DNA (figura 2B). Inoltre, sebbene Martianov et al. [ 111 ] favoriscono un modello basato sulla guida alla trascrizione del promotore antisenso, non possono escludere un'interazione diretta tra RNA e DNA per spiegare la repressione RNA-dipendente del DHFR . In modo simile, Adilakshmi et al. [ 104 ] ha suggerito che il miR-709 esercitasse il suo effetto legandosi in trans e regolando il filamento antisenso dell'EGR2promotore perché l'elemento specifico della mielina (MSE) mostra siti di legame del miRNA in entrambi i filamenti. Tuttavia, gli stessi autori affermano anche "È fuori dubbio, tuttavia, che miR-709 interagisce direttamente con il DNA promotore di MSE come indicato dalla suscettibilità del complesso al trattamento con RNasi H". Più rivelatori sono i dati generati da Miao et al. [ 102 ] dimostrando che la repressione trascrizionale di miR-552 era mediata dal legame, attraverso la sua sequenza non-seme, a un anello a forcina nella struttura cruciforme del DNA nella regione del promotore del CYP2E1 .
6. Conclusioni
Presi insieme, questi dati dimostrano che esiste un'enorme versatilità nella funzione dei miRNA. I miRNA hanno ruoli chiari sia nel citoplasma che nel nucleo dove è stato scoperto che regolano l'espressione genica attraverso diversi meccanismi. Nel nucleo (Figura 3), i dati emergenti implicano i miRNA nella regolazione della stabilità dell'mRNA nei nucleoli e nello splicing alternativo. Dati più convincenti indicano un coinvolgimento diretto nella regolazione dell'espressione genica a livello trascrizionale. Qui, i miRNA possono mediare sia l'attivazione che l'inibizione della trascrizione di un gene bersaglio. Entrambi questi processi biologici sembrano dipendere dalla presenza di una sequenza del promotore del DNA complementare alla regione del seme di un miRNA regolatorio e da un trascritto non codificante che si sovrappone al promotore del gene stesso. Il riconoscimento tra il miRNA e la sequenza complementare sull'RNA non codificante avviene attraverso il classico accoppiamento di basi Watson e Crick. Sebbene questo modello sia attualmente il più diffuso,ci sono dati che suggeriscono che il riconoscimento guidato da miRNA e l'interazione con le regioni del promotore possono verificarsi attraverso un'interazione diretta tra sequenze complementari di RNA e DNA a filamento singolo. Sono necessarie ulteriori prove per supportare questo meccanismo d'azione dei miRNA in vivo, ma questo modello alternativo è interessante per la sua semplicità e l'elevata specificità . I miRNA quindi potrebbero legarsi direttamente e specificamente al DNA promotore, proprio come fattori di trascrizione, e fungere da piattaforma per la localizzazione di regolatori trascrizionali e proteine modificatrici della cromatina nei loci genomici.I miRNA quindi potrebbero legarsi direttamente e specificamente al DNA promotore, proprio come fattori di trascrizione, e fungere da piattaforma per la localizzazione di regolatori trascrizionali e proteine modificanti la cromatina nei loci genomici.I miRNA quindi potrebbero legarsi direttamente e specificamente al DNA promotore, proprio come fattori di trascrizione, e fungere da piattaforma per la localizzazione di regolatori trascrizionali e proteine modificatrici della cromatina nei loci genomici.
Rappresentazione schematica della funzione dei miRNA nel nucleo. I miRNA nucleari possono attivare (TGA) o inibire (TGS) la trascrizione genica, bloccare la maturazione degli RNA non codificanti (LncRNA, pri-miRNA, pre-miRNA), influenzare lo splicing alternativo (freccia arancione); più controversa è la funzione dei miRNA nel nucleolo dove potrebbero influenzare la maturazione degli RNA ribosomiali (rRNA) e degli RNA messaggeri (mRNA) (freccia arancione). pri-miRNA, miRNA primario; pre-miRNA, miRNA precursori; miRISC, complesso di silenziamento che induce il miRNA.
La versatilità e la complessità dei meccanismi con cui i miRNA regolano l'espressione genica, a livello citoplasmatico e nucleare, implicano che l'alterazione dei meccanismi di regolazione dei miRNA possa influenzare le normali funzioni cellulari. L'alterazione del meccanismo di biogenesi dei miRNA, del livello di espressione dei miRNA e delle reti di regolazione dei miRNA colpisce importanti vie biologiche come la differenziazione cellulare e l'apoptosi e viene rilevata in varie malattie e sindromi umane, in particolare nel cancro (per una rassegna si veda Ghai e Wang [ 115 ).]). Tutti i tumori presentano firme specifiche dell'espressione alterata dei miRNA. Per questo motivo, i profili di espressione dei miRNA dei tumori possono rappresentare validi e utili biomarcatori per la diagnosi, la prognosi, la stratificazione dei pazienti, la definizione dei gruppi di rischio e per monitorare la risposta alla terapia. Nella maggior parte dei casi questi profili sono ottenuti da materiale bioptico. Il più grande vantaggio dell'utilizzo dei miRNA è che vengono rilasciati dal tessuto tumorale nel plasma dove possono essere facilmente raccolti e analizzati, soprattutto se incorporati in vescicole extracellulari [ 115]. Ad oggi i miRNA rappresentano la classe più promettente di biomarcatori molecolari. Altrettanto rilevante è il ruolo emergente dei microRNA nelle infezioni virali. I dati della letteratura mostrano un'interferenza reciproca tra i virus e il macchinario del miRNA della cellula ospite. Ad esempio, i virus possono alterare il percorso del miRNA della cellula ospite interagendo con proteine specifiche; sintetizzare i propri miRNA per modificare l'ambiente cellulare o per regolare i propri mRNA; o fare uso di miRNA cellulari a loro favore. Tuttavia, è anche vero che i miRNA della cellula ospite possono prendere di mira gli mRNA virali. In molti casi, questa interferenza bidirezionale viene risolta a favore dei virus che di conseguenza possono sfuggire alla risposta immunitaria e completare il ciclo di replicazione (per una rassegna si veda Verma et al [ 116 ] e Piedade e Azevedo-Pereira [ 117 )]).
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