Un nuovo preprint chiede se SASR-CoV-2 porta marcatori di tecniche di ingegneria genetica pre-pandemica. (Credito fotografico: NIAID )

Di Karolina Corin e Emily Kopp

Il genoma di COVID-19 mostra segni coerenti con la manipolazione genetica, secondo un nuovo preprint.

Il preprint (pubblicazione anticipata), pubblicato la scorsa settimana, sostiene che SARS-CoV-2, il virus che causa COVID-19, potrebbe aver avuto origine come virus sintetico in laboratorio. Non è stato ancora sottoposto a revisione paritaria o pubblicato su una rivista scientifica.

Come gran parte del lavoro di US Right to Know, il preprint esamina le prove disponibili per dare un'occhiata a quali esperimenti di virologia potrebbero essere stati intrapresi prima della pandemia.

Due teorie contrastanti sull'origine del COVID-19 hanno preso il centro della scena. Una teoria sostiene che il virus si sia riversato da mammiferi vivi venduti in un mercato di pesce, mentre l'altra ipotizza che il virus sia stato rilasciato da un laboratorio famoso per la raccolta e lo studio dei coronavirus.

Per determinare se SARS-CoV-2 avesse caratteristiche di manipolazione genetica, gli autori hanno esaminato il modello di marcatori chiamati siti di restrizione nel genoma SARS-CoV-2. I siti di restrizione sono luoghi in cui il DNA viene tagliato durante l'ingegneria genetica.

Questi siti di restrizione si trovano naturalmente nei virus, ma possono anche essere aggiunti in punti chiave del laboratorio per consentire la manipolazione genetica.

Gli autori hanno scoperto che due siti di restrizione comunemente usati per l'ingegneria genetica - BsaI e BsmBI - erano distanziati uniformemente lungo il genoma. Il frammento più lungo tra questi siti di restrizione è insolitamente breve.

Entrambi gli indizi sono tipici dei virus sintetici, secondo gli autori. Entrambi i siti di restrizione sono riconosciuti dagli enzimi di restrizione di tipo IIS, utili per l'ingegneria. Gli autori stimano che le possibilità che un virus naturale abbia un modello simile di siti di restrizione per questa famiglia di enzimi è inferiore allo 0,07%.

"Il nostro preprint ha trovato prove evidenti che suggeriscono che SARS-CoV-2 è stato assemblato con un protocollo di laboratorio noto, aggiungendo peso alla teoria che SARS-CoV-2 ha avuto origine come costrutto di laboratorio", ha affermato Alex Washburne, uno dei coautori dello studio e un biologo computazionale che ha sviluppato modelli di spillover zoonotico.

Critiche e preoccupazioni da parte di alcuni virologi

Il preprint ha sollevato le sopracciglia tra alcuni virologi.

La principale preoccupazione espressa dagli esperti è che un approccio classico utilizzato per assemblare i genomi del coronavirus - il cosiddetto "Golden Gate Assembly" - di solito rimuove i siti di restrizione o le "cicatrici" dal prodotto finale.

“Ho anche scherzato... in futuro saremo facilmente in grado di distinguere il DNA reale rispetto a quello sintetico semplicemente vedendo se sono presenti siti BsaI e BsmBI, perché la maggior parte dei metodi sintetici per produrre il DNA lascerà il prodotto finale assente questi siti", ha affermato Tom Ellis, professore di ingegneria del genoma sintetico all'Imperial College di Londra.

Sylvestre Marillonnet, pioniere del Golden Gate Assembly, ha detto all'Economist che il modello dei siti di restrizione sembrava effettivamente essere tipico dell'ingegneria, ma che è rimasto colpito dal fatto che i siti di restrizione sono rimasti nel genoma.

Stanley Perlman, un coronavirologo dell'Università dell'Iowa con esperienza in sistemi genetici inversi, ha anche pensato che fosse insolito che i siti utilizzati per generare frammenti per l'assemblaggio in vitro fossero lasciati nel genoma assemblato. Di conseguenza, ha trovato la prestampa "non molto credibile".

Tuttavia, gli autori del preprint hanno affermato di aver analizzato i coronavirus sintetici assemblati prima della pandemia e otto su dieci hanno mantenuto i loro siti di restrizione.

Anche il Golden Gate Assembly non è l'unico modo per clonare i genomi virali. Altri metodi mantengono i siti di restrizione nel genoma finale.

In effetti, gli autori sottolineano che i metodi che mantengono i siti di restrizione erano popolari presso il Wuhan Institute of Virology e un laboratorio partner negli Stati Uniti presso l'Università della Carolina del Nord.

“Abbiamo dimostrato che il metodo di gran lunga più comune per sintetizzare i coronavirus in laboratorio pre-COVID conservava i siti di restrizione modificati. Questo metodo era il metodo di sintesi più popolare presso il WIV e l'UNC", ha affermato Washburne.

"Il principale punto di partenza è che lasciarli è vantaggioso se hai intenzione di fare molti esperimenti di follow-up, ad esempio testare una libreria di mutazioni del dominio di legame del recettore", ha affermato Tony VanDongen, coautore del preprint e professore associato di farmacologia e biologia del cancro alla Duke University. "In tal caso, diventa anche economicamente più intelligente non dover assemblare l'intero genoma da zero ogni volta".

Perlman ha anche ammesso che i siti di restrizione possono essere lasciati nel genoma se gli scienziati vogliono eseguire più esperimenti. Ma ha messo in guardia dal trarre conclusioni forti, dicendo che non ci sono ancora prove che il virus fosse allo studio presso il Wuhan Institute of Virology.

Justin Kinney, professore associato al Cold Spring Harbor Laboratory che ha fornito feedback e critiche sul preprint prima che fosse pubblicato, ha fatto eco agli autori dello studio.

“Per molti studi, ha senso non inserire siti di restrizione nel prodotto finale del DNA. Ma per alcuni studi, lasciare quei siti nel prodotto finale del DNA ha molto senso", ha detto Kinney. "Ad esempio, se i ricercatori vogliono scambiare un segmento del prodotto finale del DNA con diverse versioni di quel segmento, avere siti di legame IIS strategicamente posizionati all'interno del prodotto finale del DNA ha molto senso".

“In particolare, il genoma SARS-CoV-2 ha due siti di legame BsaI ben posizionati per consentire lo scambio efficiente di una piccola parte del genoma che sappiamo essere di primario interesse per i ricercatori: la parte contenente il sito di scissione della furina e il recettore dominio vincolante", ha aggiunto.

Il dominio di legame del recettore, e in particolare la scissione della furina, sono di interesse per i virologi perché aiutano l'ingresso del virus nelle cellule umane . Il sito di scissione della furina, presente in SARS-CoV-2 ma assente in altri virus simili alla SARS, ha anche suscitato preoccupazioni sulla possibile ingegneria.

Tali preoccupazioni sono state amplificate da una proposta di sovvenzione trapelata che ha dimostrato che il Baric Lab e l'Istituto di virologia di Wuhan erano interessati a inserire siti di scissione della furina nei coronavirus.

"La proposta DEFUSE dimostra che alcuni virologi volevano testare numerose micromutazioni e combinazioni del dominio di legame del recettore e del sito di scissione della furina", ha affermato Bruttel, coautore e immunologo molecolare dell'Università di Würzburg. "Per questo, sono necessari 2 siti di restrizione unici che fiancheggiano l'S1, esattamente quello che vediamo in [SARS-CoV-2]".

Potenziale distorsione e possibilità

Alcuni critici del recente preprint affermano che la scelta di analizzare BsaI e BsmBI e non altri siti di restrizione era parziale e porterebbe a risultati distorti.

Tuttavia, Washburne ha affermato che gli autori hanno scelto BsaI e BsmBI perché il loro schema regolare si è distinto immediatamente. I siti di restrizione ideali per l'ingegneria sono distanziati uniformemente lungo il genoma per fornire frammenti genomici di lunghezze simili, mentre i siti naturali sono solitamente sparsi casualmente in tutto il genoma.

Bruttel ha aggiunto che "la maggior parte degli altri enzimi di tipo IIS non può essere combinato o produrre estremità appiccicose più corte".

Le estremità più lunghe possono facilitare il montaggio.

BsaI e BsmBI sono anche due degli enzimi di restrizione più comunemente usati per l'assemblaggio dei genomi virali.

Due laboratori che hanno impiegato BsaI e BsmI per tagliare i coronavirus includono il Wuhan Institute of Virology, che ha utilizzato i siti di restrizione per scambiare le proteine ​​spike , e il Baric Lab presso l'Università della Carolina del Nord, che ha utilizzato i siti di restrizione per ricostruire SARS-CoV-2 nel 2020 .

I critici del preprint affermano anche che la mappa del sito di restrizione apparentemente insolita osservata dagli autori potrebbe essersi verificata naturalmente, sia per mutazioni silenziose che per ricombinazione. Mutazioni silenziose alterano il DNA senza modificare alcuna proteina codificata, mentre la ricombinazione avviene quando due diversi genomi si scambiano segmenti di DNA.

Gli autori ammettono che la ricombinazione potrebbe spiegare l'insolita mappa di restrizione, ma potrebbe anche rendere i loro risultati più significativi e che sono necessarie ulteriori ricerche su questo.

Gli autori sostengono anche che le mutazioni silenziose sono una spiegazione improbabile per l'insolita mappa di restrizione di SARS-CoV-2.

"Troviamo eccezionalmente molte (e solo silenziose) mutazioni che si verificano nella piccola parte del genoma che costituisce questi siti di restrizione", afferma Bruttel.

È improbabile che un tasso così alto di mutazioni silenziose nei siti di restrizione si verifichi naturalmente e "indica che sono state manipolate", ha aggiunto.

Contraccolpo e ridicolo

Il preprint ha attirato il ridicolo da parte di eminenti sostenitori della teoria della zoonosi.

“Pura sciocchezza genuina. ... Questo documento non verrà mai pubblicato", ha detto in una e-mail Vincent Racaniello, virologo della Columbia University.

Racienello, che ha difeso il lavoro del Baric Lab e promosso la teoria dello spillover zoonotico nel suo podcast “This Week In Virology”, non ha risposto alla richiesta di una critica più specifica.

Il virologo dello Scripps Research Institute, Kristian Andersen, ha criticato il preprint come un fallimento della "biologia molecolare dell'asilo" in un thread di tweet virale.

Dopo la pubblicazione del preprint, Andersen ha affermato di aver esaminato anche lui i siti di restrizione SARS-CoV-2 tra la fine di gennaio e l'inizio di febbraio del 2020, nel periodo in cui ha presentato i suoi sospetti che il virus fosse stato progettato a un gruppo di virologi e leader di il NIH.

Andersen ha condiviso i risultati della sua analisi su Twitter, che secondo lui indicava che i siti di restrizione BsaI e BsmI sembrano trovarsi naturalmente lungo luoghi simili nel genoma di virus correlati.

Le preoccupazioni dei sostenitori della zoonosi sul Baric Lab

Le preoccupazioni sul fatto che i metodi di assemblaggio genetico in vitro sui coronavirus impiegati dal Baric Lab e dall'Istituto di virologia di Wuhan possano aver preso in considerazione l'origine del COVID-19 non sono nuove.

Quando la pandemia ha preso velocità per la prima volta a gennaio e febbraio 2020, i leader del National Institutes of Health (NIH) e i migliori virologi, tra cui Andersen, si sono preoccupati per un controverso esperimento di guadagno di funzione condotto dal Baric Lab e dal Wuhan Institute of Virology che genomi chimerici di coronavirus simili alla SARS assemblati utilizzando diversi siti di restrizione.

Gli scienziati erano preoccupati che i metodi descritti nel documento delineassero "un manuale di istruzioni per costruire il coronavirus di Wuhan in un laboratorio".