AUSTIN, Texas — Una delle grandi sfide nell'uso dell'editing genetico basato su CRISPR sugli esseri umani è che il macchinario molecolare a volte apporta modifiche alla sezione sbagliata del genoma di un ospite, creando la possibilità che un tentativo di riparare una mutazione genetica in un punto in il genoma potrebbe accidentalmente creare una nuova pericolosa mutazione in un altro.
Ma ora, gli scienziati dell'Università del Texas ad Austin hanno riprogettato un componente chiave di uno strumento di editing genetico basato su CRISPR ampiamente utilizzato, chiamato Cas9, in modo che abbia migliaia di volte meno probabilità di colpire il tratto sbagliato di DNA pur rimanendo altrettanto efficiente come la versione originale, rendendolo potenzialmente molto più sicuro. Il lavoro è descritto in un articolo pubblicato oggi sulla rivista Nature .
"Questo potrebbe davvero essere un punto di svolta in termini di una più ampia applicazione dei sistemi CRISPR Cas nell'editing genetico", ha affermato Kenneth Johnson, professore di bioscienze molecolari e co-autore senior dello studio con David Taylor, assistente professore di scienze molecolari bioscienze. I co-primi autori del documento sono i borsisti post-dottorato Jack Bravo e Mu-Sen Liu.
Altri laboratori hanno riprogettato Cas9 per ridurre le interazioni fuori bersaglio, ma finora tutte queste versioni migliorano la precisione sacrificando la velocità. SuperFi-Cas9, come è stata soprannominata questa nuova versione, ha 4.000 volte meno probabilità di tagliare i siti target, ma è altrettanto veloce di Cas9 naturale. Bravo dice che puoi pensare alle diverse versioni generate in laboratorio di Cas9 come diversi modelli di auto a guida autonoma. La maggior parte dei modelli sono davvero sicuri, ma hanno una velocità massima di 10 miglia orarie.
"Sono più sicuri dei Cas9 presenti in natura, ma hanno un costo elevato: stanno andando molto lentamente", ha affermato Bravo. "SuperFi-Cas9 è come un'auto a guida autonoma progettata per essere estremamente sicura, ma può comunque andare a tutta velocità".
Finora, i ricercatori hanno dimostrato l'uso di SuperFi-Cas9 sul DNA in provetta. Ora stanno collaborando con altri ricercatori che intendono testare SuperFi-Cas9 per l'editing genetico nelle cellule viventi. Stanno anche lavorando per sviluppare versioni ancora più sicure e attive di Cas9.
Gli strumenti di modifica genetica basati su CRISPR sono adattati dai sistemi presenti in natura nei batteri. In natura, una proteina Cas9 fluttua nell'ambiente, alla ricerca di DNA con una sequenza molto specifica di 20 lettere, come la X su una mappa pirata che indica "scava qui". A volte, quando la maggior parte delle lettere è corretta, ad eccezione di quelle nei punti da 18 a 20, Cas9 continua a scavare. Questo è chiamato mancata corrispondenza e può avere conseguenze disastrose nell'editing genetico.
Taylor e Johnson hanno sviluppato una tecnica chiamata determinazione della struttura guidata dalla cinetica che ha utilizzato un microscopio crioelettronico nel Sauer Structural Biology Lab per scattare istantanee di Cas9 in azione mentre interagiva con questo DNA non corrispondente.
Sono rimasti sorpresi di scoprire che quando Cas9 incontra questo tipo di discrepanza nelle posizioni da 18 a 20, invece di arrendersi e andare avanti, ha una struttura simile a un dito che piomba dentro e si aggrappa al DNA, facendolo agire come se era la sequenza corretta. Normalmente, una mancata corrispondenza lascia il DNA un po' floscio; questa struttura simile a un dito lo stabilizza.
"È come se avessi una sedia e una delle gambe fosse stata spezzata e tu l'avessi semplicemente incollata di nuovo insieme", ha detto Bravo. “Potrebbe ancora funzionare come una sedia, ma potrebbe essere un po' traballante. È una soluzione piuttosto sporca.
Senza quella stabilità aggiuntiva nel DNA, Cas9 non esegue gli altri passaggi necessari per tagliare il DNA e apportare modifiche. Nessuno aveva mai osservato questo dito in più fare questa stabilizzazione prima.
"Questo era qualcosa che non avrei mai potuto, in un milione di anni, immaginato nella mia mente sarebbe successo", ha detto Taylor.
Sulla base di questa intuizione, hanno ridisegnato il dito in più su Cas9 in modo che invece di stabilizzare la parte del DNA contenente la mancata corrispondenza, il dito venga invece allontanato dal DNA, impedendo a Cas9 di continuare il processo di taglio e modifica del DNA. Il risultato è SuperFi-Cas9, una proteina che taglia il bersaglio giusto con la stessa rapidità della Cas9 presente in natura, ma è molto meno probabile che tagli il bersaglio sbagliato.
Altri autori sono Grace Hibshman, Tyler Dangerfield, Kyungseok Jung e Ryan McCool, anche loro dell'Università del Texas ad Austin.
Bravo, Liu, Hibshman, Dangerfield, Johnson e Taylor sono gli inventori di una domanda di brevetto relativa a nuovi design Cas9 basati su questo lavoro. L'Ufficio per la commercializzazione della tecnologia dell'UT Austin sta gestendo la proprietà intellettuale e sta lavorando per trovare partner industriali che possano aiutare a realizzare il vasto potenziale della tecnologia.
Questo lavoro è stato sostenuto in parte dalla Fondazione Welch e dalla Fondazione Robert J. Kleberg, Jr. e Helen C. Kleberg. Taylor è uno studioso del CPRIT supportato dal Cancer Prevention and Research Institute del Texas. Taylor è anche supportato dal David Taylor Excellence Fund in Structural Biology, reso possibile con il supporto di Judy e Henry Sauer.
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