Alcuni sono legati agli enzimi che tagliano il DNA. Altri sono un completo mistero.

 La struttura proteica del CAS, mostrata con gli acidi nucleici legati.

Bang Wong, Broad Institute

CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) è la risposta del mondo microbico all’immunità adattativa. I batteri non generano anticorpi quando vengono invasi da un agente patogeno e poi tengono in sospeso quegli anticorpi nel caso in cui incontrino nuovamente lo stesso agente patogeno, come facciamo noi. Invece, incorporano parte del DNA dell'agente patogeno nel proprio genoma e lo collegano a un enzima che può usarlo per riconoscere quella sequenza di DNA patogeno e tagliarla a pezzi se l'agente patogeno si ripresenta.

L'enzima che effettua il taglio si chiama Cas, per associato a CRISPR. Sebbene il sistema CRISPR-Cas si sia evoluto come meccanismo di difesa batterica, è stato sfruttato e adattato dai ricercatori come potente strumento per la manipolazione genetica negli studi di laboratorio. Ha dimostrato anche usi agricoli e la prima terapia basata su CRISPR è stata appena approvata nel Regno Unito per il trattamento dell’anemia falciforme e della beta-talassemia dipendente dalle trasfusioni.

Ora, i ricercatori hanno sviluppato un nuovo modo per cercare nei genomi sistemi simili a CRISPR-Cas. E hanno scoperto che potremmo avere molti strumenti aggiuntivi con cui lavorare.

Modificare il DNA

Ad oggi, sono stati identificati sei tipi di sistemi CRISPR-Cas in vari microbi. Sebbene differiscano nei dettagli, hanno tutti lo stesso fascino: forniscono proteine ​​a una determinata sequenza di materiale genetico con un grado di specificità che finora è stato tecnicamente difficile, costoso e dispendioso in termini di tempo da raggiungere. Qualsiasi sequenza di DNA di interesse può essere programmata nel sistema e mirata.

I sistemi nativi presenti nei microbi solitamente apportano una nucleasi, un enzima che taglia il DNA, alla sequenza, per sminuzzare il materiale genetico di un agente patogeno. Questa capacità di tagliare qualsiasi sequenza di DNA scelta può essere utilizzata per l'editing genetico; insieme ad altri enzimi e/o sequenze di DNA, può essere utilizzato per inserire o eliminare ulteriori brevi sequenze, correggendo i geni mutanti. Alcuni sistemi CRISPR-Cas scindono specifiche molecole di RNA anziché DNA. Questi possono essere utilizzati per eliminare l’RNA patogeno, come i genomi di alcuni virus, nello stesso modo in cui vengono eliminati nei batteri nativi. Questo può essere utilizzato anche per correggere i difetti nell'elaborazione dell'RNA.

Ma ci sono molti altri modi per modificare gli acidi nucleici che potrebbero essere utili. Ed è una questione aperta se gli enzimi che eseguono ulteriori modifiche si siano evoluti. Quindi, alcuni ricercatori hanno deciso di cercarli.

I ricercatori del MIT hanno sviluppato un nuovo strumento per rilevare array CRISPR variabili e lo hanno applicato a coppie di basi di 8,8 tera (10 12 ) di informazioni genomiche procariotiche. Molti dei sistemi che hanno trovato sono rari e sono apparsi nel set di dati solo negli ultimi 10 anni, evidenziando quanto sia importante continuare ad aggiungere campioni ambientali che in precedenza erano difficili da ottenere in questi archivi di dati.

Il nuovo strumento era necessario perché i database delle sequenze di proteine ​​e acidi nucleici si stanno espandendo a un ritmo ridicolo, quindi le tecniche per analizzare tutti questi dati devono tenere il passo. Alcuni algoritmi utilizzati per analizzarli cercano di confrontare ogni sequenza con tutte le altre, il che è ovviamente insostenibile quando si ha a che fare con miliardi di geni. Altri si affidano al clustering, ma questi trovano solo geni molto simili, quindi non possono davvero far luce sulle relazioni evolutive tra proteine ​​lontanamente imparentate. Ma il clustering rapido basato su hashtag sensibile alla località (“flash clust”) funziona raggruppando miliardi di proteine ​​in meno cluster di sequenze più grandi che differiscono leggermente per identificare nuovi e rari parenti.

La ricerca effettuata utilizzando FLSHclust ha estratto con successo 188 nuovi sistemi CRISPR-Cas.

Un sacco di CRISPyness

Dal lavoro sono emersi alcuni temi. Uno è che alcuni dei sistemi CRISPR appena identificati utilizzano enzimi Cas con domini mai visti prima o sembrano essere fusioni con geni noti. Gli scienziati hanno ulteriormente caratterizzato alcuni di questi e ne hanno scoperto uno più specifico degli enzimi CRISPR attualmente in uso, e un altro che taglia l'RNA che propongono sia strutturalmente abbastanza distinto da comprendere un settimo tipo completamente nuovo di sistema CRISPR-Cas.

Un corollario di questo tema è il collegamento di enzimi con funzionalità diverse, non solo nucleasi (enzimi che tagliano DNA e RNA), con gli array CRISPR. Gli scienziati hanno sfruttato la notevole capacità di targeting genetico di CRISPR collegandolo ad altri tipi di enzimi e molecole, come i coloranti fluorescenti. Ma ovviamente l’evoluzione è arrivata prima.

Ad esempio, FLSHclust ha identificato qualcosa chiamato trasposasi associato a due diversi tipi di sistemi CRISPR. Una trasposasi è un enzima che aiuta un particolare tratto di DNA a passare a un'altra parte del genoma. La trasposizione guidata da RNA CRISPR è stata vista in precedenza, ma questo ne è un altro esempio. Tutta una serie di proteine ​​con funzioni diverse, come proteine ​​con domini transmembrana e molecole di segnalazione, sono state trovate collegate agli array CRISPR, evidenziando la natura mix-n-match dell'evoluzione di questi sistemi. Hanno anche trovato una proteina espressa da un virus che si lega agli array CRISPR e li rende inattivi: in sostanza, il virus inattiva il sistema CRISPR che si è evoluto per proteggersi dai virus.

I ricercatori non solo hanno trovato nuove proteine ​​associate agli array CRISPR, ma hanno anche trovato altri array ripetuti regolarmente interspaziati che non erano associati ad alcun enzima cas, simili a CRISPR ma non CRISPR. Non sono sicuri di quale potrebbe essere la funzionalità di questi sistemi guidati dall’RNA, ma ipotizzano che siano coinvolti nella difesa proprio come lo è CRISPR.

Gli autori si proponevano di trovare "un catalogo di proteine ​​guidate dall'RNA che ampliassero la nostra comprensione della biologia e dell'evoluzione di questi sistemi e fornissero un punto di partenza per lo sviluppo di nuove biotecnologie". Sembra che abbiano raggiunto il loro obiettivo: "I risultati di questo lavoro rivela una flessibilità organizzativa e funzionale e una modularità senza precedenti dei sistemi CRISPR", scrivono. Proseguono concludendo: "Ciò rappresenta solo una piccola frazione dei sistemi scoperti, ma illumina la vastità e il potenziale non sfruttato della biodiversità della Terra, e il i candidati rimanenti serviranno come risorsa per l’esplorazione futura”.

Articolo DOI: 10.1126/science.adi1910